云顶国际基因编辑平台初建于2009年公司成立之初，主要负责研发动物、细胞模型。基因编辑模型不仅在基础科学研究中发挥了极大地作用，也可以解决抗体药物研发过程中的诸多关键问题。使用全人抗体RenMab小鼠，可以直接获得全人序列且经过免疫系统筛选的抗体分子。全人共同轻链抗体RenLite小鼠中获得的全人序列抗体分子，具有重排后的相同轻链序列，这解决了双特异抗体在蛋白表达过程中的错配问题。而仅重链抗体RenNano小鼠可以用于开发全人序列的纳米抗体。

此外，当筛选的抗体分子只能够识别人靶点，而不识别小鼠同源靶点时，靶点人源化小鼠/细胞模型则可以解决其在药物安全性评价、药效评价、机制研究等方面所面临的问题。除了以上应用，基因编辑模型的作用实际上非常广泛，比如：通过修饰某些基因而提高抗原的免疫反应，通过遗传改造诱导制备疾病模型，等。

经过多年的自主技术研发，云顶国际建立了三个主要的基因编辑技术体系：（1）基于小鼠胚胎干细胞的ESC/HR技术，我们自主建立的小鼠胚胎干细胞系可以经过近70次的传代仍然具有发育全能性，允许在同一染色体进行多轮的基因改造；（2）EGE技术，将CRISPR/Cas9介导的基因敲进效率提高近20倍。（3）SUPCE技术，不受DNA片段长度限制，最多通过3次的小鼠胚胎干细胞操作，即可一次性人源化超大基因片段。综合三种技术体系，我们克服了基因编辑技术中普遍存在的问题，实现了高效率、大规模、多重改造、超大基因人源化，几乎可以实现任意长度、任意位点的精确基因组编辑。

除了自主研发的基因编辑技术，建立自动化、高通量的技术流程才能够保证快速稳定的大规模模型制备。平台配备了多台96通道核酸提取仪用于小鼠/细胞基因组DNA和质粒DNA的提取。使用自动化移液工作站实现了基因型检测的全自动化操作。基因编辑平台现每年可以实现1500个以上的模型开发工作。

ESC/HR

ESC/HR (ESC, Embryonic Stem Cell; HR, Homologous Recombination) 是在小鼠胚胎干细胞中，利用供体DNA与基因组之间的同源重组进行基因编辑的一种技术。基因改造的阳性克隆可以通过注射到小鼠囊胚和后续的繁育最终获得成体小鼠。云顶国际自主建立的C57BL/6背景的干细胞系以及培养体系，可以保证经过近100次的传代后仍可以具有全能性，获得成体小鼠。

EGE

EGE (Extreme Genome Editing system) 是一种以CRISPR/Cas9为基础，经过自主研发优化后，将基因敲进效率提高近20倍的基因编辑技术。虽然CRISPR/Cas9极大提高了同源重组的发生概率，简化了基因编辑操作，但在大规模的模型制备中仍然存在效率低、成本高的问题。EGE系统使得基因编辑更加快速、便捷，可以精确编辑几乎任何基因组位点的DNA序列。基因编辑效率的提高带来了多方面的好处。首先，对于模式动物制备，提高了成功率，节约了成本，缩短了周期，更有利于工业化及大规模的商业应用；其次，鉴于不同基因的改造难度不同，对于部分非常难以改造的基因组位点，EGE技术对效率的提高则有望将不可能变为可能。

图1. EGE系统大幅提高基于CRISPR/Cas9的基因敲进效率

在第一个模型中（图左），使用人骨肉瘤细胞，设计方案为在人细胞骨架蛋白β-Actin基因ACTB的起始密码子ATG后敲进绿色荧光蛋白EGFP，成功敲进的细胞会表达EGFP融合的β-Actin蛋白。U2OS细胞转染表达Cas9核酸酶与靶向ACTB的sgRNA质粒，以及两侧含有约1kb长度同源臂的EGFP供体质粒。转染后通过流式细胞术分析，基本的Cas9/sgRNA介导的敲进效率为1.91%，而EGE系统可以将敲进效率提高至15.02%。在第二个模型中（图右），选择大鼠胶质瘤C6细胞，以及编码核膜蛋白的大鼠Lmnb1基因作为靶点。在这个模型中EGE系统将敲进效率从0.19%提高至3.6%。

图2. EGE技术实现在细胞中同时标记两个基因

在U2OS细胞中共转染分别靶向ACTB，LMNB1基因的Cas9/sgRNA质粒，以及标记ACTB的绿色荧光蛋白GFP供体质粒，标记LMNB1基因的红色荧光蛋白mCherry供体质粒。转染后荧光显微镜观察，可以发现红色的核膜蛋白与绿色的细胞骨架蛋白。

SUPCE

SUPCE (Size-Unlimited and Precise Chromosome Engineering system) 是一种不受DNA片段长度限制的基因组编辑技术。以往使用质粒或细菌人工染色体(BAC, Bacterial Artificial Chromosome) 进行大片段的替换需要在小鼠胚胎干细胞中进行多轮的改造。由于供体容量的限制，改造的次数与替换片段的长度成正比。小鼠ES细胞在体外长期操作很容易失去其全能性，从而造成无法获得成体小鼠。SUPCE在本质上解决了这个问题。在理论上，无论需要替换的片段是多大，就只需要三轮的小鼠ES细胞改造，即可成功实现目的片段的替换。

利用SUPCE技术，云顶国际成功开发了全人抗体RenMab小鼠 （图1），图2的FISH检测结果验证了人重链、κ轻链序列成功替换至小鼠基因组的对应位置。除了抗体基因，SUPCE技术也可应用于其它超大基因簇的人源化，如：T细胞受体 (TCR, T-Cell Receptor)，主要组织相容性复合体 (MHC, Major Histocompatibility Complex)，NK细胞基因簇(NKC, NK Cluster) 等。

图1. RenMab小鼠中抗体基因人源化设计示意图

在RenMab小鼠中，一次性将2.6 Mb的小鼠重链可变区替换为1.0 Mb的人重链可变区序列，将3.2 Mb的小鼠κ轻链可变区替换为1.6 Mb的人轻链可变区序列。

图2. 抗体基因可变区人源化替换的FISH检测结果

利用SUPCE技术在小鼠胚胎干细胞中分别将小鼠重链、κ轻链的可变区替换为完整的人源序列。a. 使用人重链可变区序列探针（绿色），小鼠Igh所在的#12号染色体全涂染探针（红色），对重链人源化细胞克隆进行检测。b. 使用人κ轻链可变区序列探针（红色），小鼠Igk所在的#6号染色体全涂染探针（绿色），对κ轻链人源化细胞克隆进行检测。